Cекреты благополучия женщины

Подпишитесь на лентуПодпишитесь на лентуTwitterTwitterВКонтактеВКонтактеВидеоВидеоFacebookFacebook

Электрофорез для поясницы


Электрофорез на шейный и поясничный отделы позвоночника

Электрофорез – метод физиотерапевтического воздействия на пораженные участки опорно-двигательного аппарата. Суть процедуры состоит в доставке лекарственного вещества к глубоко расположенным тканям с помощью их поляризации.

Этот метод лечебного воздействия широко применяется в вертебрологии для лечения остеохондроза и его последствий (например, грыжи диска). Именно электрофорез позволяет доставить лекарственное средство в ткани позвоночника, такие как межпозвонковые диски.

Особенностью физиотерапии этого типа является возможность применения электр

Руководство по поиску и устранению неисправностей электрофореза нуклеиновой кислоты | Thermo Fisher Scientific

Возможные причины Рекомендации
Препарат в геле
Густой гель
  • Сохраняйте толщину геля около 3–4 мм при заливке горизонтальных гелей агарозы. Гели толщиной более 5 мм могут привести к диффузии полос во время электрофореза.
Плохо сформированные скважины
  • Тщательно очистите гребешок для геля, прежде чем использовать его для заливки геля.
  • Во избежание протекания пробы через дно геля и размазывания полос пробы не проталкивайте гребешок до дна горизонтального геля.
  • Избегайте переполнения лотка для геля, так как это может привести к подключению лунок.
  • Прежде чем снимать гребешок, подождите, пока сформировались лунки.
  • Как только гель затвердеет, осторожно и постепенно снимите гребешок, чтобы не повредить лунки.
Неправильный тип геля
  • Для электрофореза одноцепочечных нуклеиновых кислот (например,g., РНК), приготовьте денатурирующий гель для эффективного разделения. С другой стороны, избегайте использования денатурирующих гелей с образцами двухцепочечной ДНК.
Пробоподготовка
Образец перегружен
  • Используйте не более необходимого количества образцов для гель-электрофореза; Обычно рекомендуется 0,1–0,2 мкг образца на миллиметр ширины лунки геля. Расплывчатые мазки, деформированные или U-образные полосы и полосы, которые кажутся сросшимися, являются общей характеристикой перегруженных гелей.
Образец деградирован
  • Убедитесь, что выбранные реагенты соответствуют требованиям молекулярной биологии и что лабораторное оборудование не содержит нуклеаз. Соблюдайте надлежащие лабораторные практики (например, используйте перчатки, предотвращайте заражение нуклеазами, работайте в специально отведенных местах и ​​т. Д.) При работе с нуклеиновыми кислотами, особенно при работе с РНК.
Образец в высокосолевом буфере
  • Убедитесь, что концентрация соли загрузочного буфера совместима с выбранным гелем.При необходимости разбавьте загрузочный буфер.
  • Если образец нуклеиновой кислоты уже находится в буфере с высоким содержанием соли, разбавьте образец водой, свободной от нуклеаз, перед добавлением загрузочного буфера. При необходимости очистите или осаждайте образец нуклеиновой кислоты и ресуспендируйте его в воде, свободной от нуклеаз, для удаления избытка соли.
Образец, содержащий большое количество белка
Несовместимый буфер загрузки
  • Для электрофореза одноцепочечных нуклеиновых кислот используйте загрузочный краситель, содержащий денатурирующий агент, а затем нагрейте образец, чтобы предотвратить образование нежелательных дуплексов.
  • Для электрофореза двухцепочечной ДНК избегайте загрузки красителя денатурантом и не нагревайте образец, чтобы сохранить дуплексную структуру.
Гель
Пузыри, появившиеся во время загрузки образца
  • Убедитесь, что во время загрузки образца в лунку не попали пузырьки воздуха, чтобы избежать искажения полосы.
Колодец поврежден при загрузке образца
  • Избегайте прокалывания лунок наконечниками пипеток во время загрузки образца.
Лунки для проб, содержащие остаточный акриламид и / или мочевину
  • При использовании полиакриламидных гелей смывайте остаточный акриламид (и мочевину, в случае денатурирующих гелей) из лунок перед загрузкой образца.
Очень низкое или высокое напряжение
  • Подайте напряжение в соответствии с рекомендациями для диапазона размеров нуклеиновых кислот и используемого рабочего буфера.Очень низкое или высокое напряжение может привести к неоптимальному разрешению при разделении нуклеиновых кислот.
Очень короткое или длительное время работы
  • Нанесите гель достаточно долго, чтобы полосы полностью рассосались. Однако очень длительный цикл может привести к чрезмерному нагреву, денатурированию образцов и диффузии полос.
Несовместимый рабочий буфер
  • Убедитесь, что буфер для приготовления геля и рабочий буфер совместимы и приготовлены правильно.
  • Используйте буфер с высокой буферной емкостью для электрофореза более 2 часов.
Образец визуализации
Ленточная диффузия
  • Избегайте хранения геля или большой задержки между завершением электрофореза и визуализацией геля. Полосы меньшего размера молекул, а также окрашивание нуклеиновой кислоты, включенное в гель, могут стать диффузными.
Совместно мигрирующие ленты
  • Используйте соответствующий процент геля, напряжение и время анализа для разделения полос с аналогичными размерами молекул.Совместно мигрирующие полосы часто выглядят как диффузная, толстая и яркая.
Камера вне фокуса
  • Убедитесь, что камера находится в фокусе, если гель просматривается через линзу для отображения на экране.
.

типов электрофореза - принцип и типы электрофореза на BYJU’S

    • Классы
      • Класс 1-3
      • Класс 4-5
      • Класс 6-10
      • Класс 11-12
    • КОНКУРСНЫЙ ЭКЗАМЕН
      • BNAT 000 NC
        • 000 NC Книги
          • Книги NCERT для класса 5
          • Книги NCERT для класса 6
          • Книги NCERT для класса 7
          • Книги NCERT для класса 8
          • Книги NCERT для класса 9
          • Книги NCERT для класса 10
          • Книги NCERT для класса 11
          • Книги NCERT для класса 12
        • NCERT Exemplar
          • NCERT Exemplar Class 8
          • NCERT Exemplar Class 9
          • NCERT Exemplar Class 10
          • NCERT Exemplar Class 11
          • NCERT 9000 9000
          • NCERT Exemplar Class
            • Решения RS Aggarwal, класс 12
            • Решения RS Aggarwal, класс 11
            • Решения RS Aggarwal, класс 10
            • 90 003 Решения RS Aggarwal класса 9
            • Решения RS Aggarwal класса 8
            • Решения RS Aggarwal класса 7
            • Решения RS Aggarwal класса 6
          • Решения RD Sharma
            • RD Sharma Class 6 Решения
            • Решения RD Sharma
            • Решения RD Sharma Class 8
            • Решения RD Sharma Class 9
            • Решения RD Sharma Class 10
            • Решения RD Sharma Class 11
            • Решения RD Sharma Class 12
          • PHYSICS
            • Механика
            • Оптика
            • Термодинамика Электромагнетизм
          • ХИМИЯ
            • Органическая химия
            • Неорганическая химия
            • Периодическая таблица
          • MATHS
            • Теорема Пифагора
            • 0004
            • 000300030004
            • Простые числа
            • Взаимосвязи и функции
            • Последовательности и серии
            • Таблицы умножения
            • Детерминанты и матрицы
            • Прибыль и убыток
            • Полиномиальные уравнения
            • Деление фракций
          • 000
          • 000
          • 000
          • 000
          • 000
          • 000 Microology
          • 000
          • 000 Microology
          • 000 BIOG3000
              FORMULAS
              • Математические формулы
              • Алгебраические формулы
              • Тригонометрические формулы
              • Геометрические формулы
            • КАЛЬКУЛЯТОРЫ
              • Математические калькуляторы
              • 0003000 PBS4000
              • 000300030002 Примеры калькуляторов химии
              • Класс 6
              • Образцы бумаги CBSE для класса 7
              • Образцы бумаги CBSE для класса 8
              • Образцы бумаги CBSE для класса 9
              • Образцы бумаги CBSE для класса 10
              • Образцы бумаги CBSE для класса 11
              • Образцы бумаги CBSE чел. для класса 12
            • CBSE - вопросник за предыдущий год
              • CBSE - вопросник за предыдущий год, класс 10
              • CBSE - за предыдущий год - вопросник, класс 12
            • HC Verma Solutions
              • HC Verma Solutions Class 11 Physics
              • Решения HC Verma, класс 12, физика
            • Решения Лакмира Сингха
              • Решения Лакмира Сингха, класс 9
              • Решения Лакмира Сингха, класс 10
              • Решения Лакмира Сингха, класс 8
            • Заметки CBSE
            • , класс
                CBSE Notes
                  Примечания CBSE класса 7
                • Примечания CBSE класса 8
                • Примечания CBSE класса 9
                • Примечания CBSE класса 10
                • Примечания CBSE класса 11
                • Примечания CBSE класса 12
              • Примечания к редакции CBSE
                • Примечания к редакции
                • CBSE
                • Примечания к редакции класса 10 CBSE
                • Примечания к редакции класса 11 CBSE 9000 4
                • Примечания к редакции класса 12 CBSE
              • Дополнительные вопросы CBSE
                • Дополнительные вопросы по математике класса 8 CBSE
                • Дополнительные вопросы по науке 8 класса CBSE
                • Дополнительные вопросы по математике класса 9 CBSE
                • Дополнительные вопросы по науке класса 9 CBSE
                • Дополнительные вопросы по математике для класса 10
                • Дополнительные вопросы по науке, класс 10 по CBSE
              • CBSE, класс
                • , класс 3
                • , класс 4
                • , класс 5
                • , класс 6
                • , класс 7
                • , класс 8
                • , класс 9 Класс 10
                • Класс 11
                • Класс 12
              • Учебные решения
            • Решения NCERT
              • Решения NCERT для класса 11
                • Решения NCERT для класса 11 по физике
                • Решения NCERT для класса 11 Химия
                • Решения для биологии класса 11
                • Решения NCERT для математики класса 11
                • 9 0003 NCERT Solutions Class 11 Accountancy
                • NCERT Solutions Class 11 Business Studies
                • NCERT Solutions Class 11 Economics
                • NCERT Solutions Class 11 Statistics
                • NCERT Solutions Class 11 Commerce
              • NCERT Solutions For Class 12
                • NCERT Solutions For Класс 12 по физике
                • Решения NCERT для химии класса 12
                • Решения NCERT для класса 12 по биологии
                • Решения NCERT для класса 12 по математике
                • Решения NCERT Класс 12 Бухгалтерия
                • Решения NCERT, класс 12, бизнес-исследования
                • Решения NCERT, класс 12 Экономика
                • NCERT Solutions Class 12 Accountancy Part 1
                • NCERT Solutions Class 12 Accountancy Part 2
                • NCERT Solutions Class 12 Micro-Economics
                • NCERT Solutions Class 12 Commerce
                • NCERT Solutions Class 12 Macro-Economics
              • NCERT Solutions For Класс 4
                • Решения NCERT для математики класса 4
                • Решения NCERT для класса 4 EVS
              • Решения NCERT для класса 5
                • Решения NCERT для математики класса 5
                • Решения NCERT для класса 5 EVS
              • Решения NCERT для класса 6
                • Решения NCERT для математики класса 6
                • Решения NCERT для науки класса 6
                • Решения NCERT для социальных наук класса 6
                • Решения NCERT для класса 6 Английский
              • Решения NCERT для класса 7
                • Решения NCERT для класса 7 Математика
                • Решения NCERT для класса 7 Наука
                • Решения NCERT для класса 7 по социальным наукам
                • Решения NCERT для класса 7 Английский
              • Решения NCERT для класса 8
                • Решения NCERT для класса 8 Математика
                • Решения NCERT для класса 8 Science
                • Решения NCERT для социальных наук 8 класса
                • Решение NCERT ns для класса 8 Английский
              • Решения NCERT для класса 9
                • Решения NCERT для социальных наук класса 9
              • Решения NCERT для математики класса 9
                • Решения NCERT для математики класса 9 Глава 1
                • Решения NCERT для Математика класса 9 Глава 2
                • Решения NCERT для математики класса 9 Глава 3
                • Решения NCERT для математики класса 9 Глава 4
                • Решения NCERT
                • для математики класса 9 Глава 5
                • Решения NCERT для математики класса 9 Глава 6
                • Решения NCERT для Математика класса 9 Глава 7
                • Решения NCERT для математики класса 9 Глава 8
                • Решения NCERT
                • для математики класса 9 Глава 9
                • Решения NCERT
                • для математики класса 9 Глава 10
                • Решения NCERT для математики класса 9 Глава 11
                • Решения NCERT для Математика класса 9 Глава 12
                • Решения NCERT для математики класса 9 Глава 13
                • Решения
                • NCERT для математики класса 9 Глава 14
                • Решения NCERT для математики класса 9 Глава 15
              • Решения NCERT для науки класса 9
                • Решения NCERT для науки класса 9 Глава 1
                • Решения NCERT для науки класса 9 Глава 2
                • Решения NCERT для класса 9 Наука Глава 3
                • Решения NCERT для Науки Класса 9 Глава 4
                • Решения NCERT для Науки Класса 9 Глава 5
                • Решения NCERT для Науки Класса 9 Глава 6
                • Решения NCERT для Науки Класса 9 Глава 7
                • Решения NCERT для Класса 9 Наука Глава 8
                • Решения NCERT для Науки Класса 9 Глава 9
                • Решения NCERT для Науки Класса 9 Глава 10
                • Решения NCERT для Науки Класса 9 Глава 12
                • Решения NCERT для Науки Класса 9 Глава 11
                • Решения NCERT для Класса 9 Наука Глава 13
                • Решения NCERT для класса 9 Наука Глава 14
                • Решения NCERT для класса 9 по науке Глава 15
              • Решения NCERT для класса 10
                • Решения NCERT для класса 10 по социальным наукам
              • Решения NCERT для математики класса 10
                • Решения NCERT для математики класса 10 Глава 1
                • Решения NCERT для математики класса 10 Глава 2
                • Решения NCERT для математики класса 10 Глава 3
                • Решения NCERT для математики класса 10 Глава 4
                • Решения NCERT для математики класса 10 Глава 5
                • Решения NCERT для математики класса 10 Глава 6
                • Решения NCERT для математики класса 10 Глава 7
                • Решения NCERT для математики класса 10 Глава 8
                • Решения NCERT для математики класса 10 Глава 9
                • Решения NCERT
                • для математики класса 10 Глава 10
                • Решения
                • NCERT для математики класса 10 Глава 11
                • Решения NCERT для математики класса 10 Глава 12
                • Решения NCERT для математики класса 10 Глава 13
                • NCERT Sol Решения NCERT для математики класса 10 Глава 14
                • Решения NCERT для математики класса 10 Глава 15
              • Решения NCERT для науки класса 10
                • Решения NCERT для науки класса 10 Глава 1
                • Решения NCERT для науки класса 10 Глава 2
                • Решения NCERT для науки класса 10, глава 3
                • Решения NCERT для науки класса 10, глава 4
                • Решения NCERT для науки класса 10, глава 5
                • Решения NCERT для науки класса 10, глава 6
                • Решения NCERT для науки класса 10, глава 7
                • Решения NCERT для науки 10 класса, глава 8
                • Решения NCERT для науки класса 10 Глава 9
                • Решения NCERT для науки класса 10 Глава 10
                • Решения NCERT для науки класса 10 Глава 11
                • Решения NCERT для науки класса 10 Глава 12
                • Решения NCERT для науки 10 класса Глава 13
                • Решения NCERT для науки 10 класса Глава 14
                • Решения NCERT для науки 10 класса Глава 15
                • Решения NCERT для науки 10 класса Глава 16
              • Учебный план NCERT
              • NCERT
            • Commerce
              • Class 11 Commerce Syllabus
                  ancy Account
                • Программа бизнес-исследований 11 класса
                • Учебная программа по экономике 11 класса
              • Учебная программа по коммерции 12 класса
                • Учебная программа по бухгалтерии 12 класса
                • Учебная программа по бизнесу 12 класса
                • Учебная программа по экономике
                • 9000 9000
                    • Образцы документов по коммерции класса 11
                    • Образцы документов по коммерции класса 12
                  • TS Grewal Solutions
                    • TS Grewal Solutions Class 12 Accountancy
                    • TS Grewal Solutions Class 11 Accountancy
                  • Отчет о движении денежных средств
                  • Что такое Entry eurship
                  • Защита прав потребителей
                  • Что такое основной актив
                  • Что такое баланс
                  • Формат баланса
                  • Что такое акции
                  • Разница между продажами и маркетингом
                • ICSE
                  • Документы
                  • ICSE
                  • Вопросы ICSE
                  • ML Aggarwal Solutions
                    • ML Aggarwal Solutions Class 10 Maths
                    • ML Aggarwal Solutions Class 9 Maths
                    • ML Aggarwal Solutions Class 8 Maths
                    • ML Aggarwal Solutions Class 7 Maths
                    • ML 6 Maths
                    • ML 6 Maths
                  • Selina Solutions
                    • Selina Solutions для класса 8
                    • Selina Solutions для Class 10
                    • Selina Solutions для Class 9
                  • Frank Solutions
                    • Frank Solutions для математики класса 10
                    • Frank Solutions для математики класса 9
                  • Класс ICSE 9000 2
                  • ICSE Class 6
                  • ICSE Class 7
                  • ICSE Class 8
                  • ICSE Class 9
                  • ICSE Class 10
                  • ISC Class 11
                  • ISC Class 12
              • IAS
              • Exam
              • IAS
              • IAS
              • Civil
              • Сервисный экзамен
              • Программа UPSC
              • Бесплатная подготовка к IAS
              • Текущие события
              • Список статей IAS
              • Пробный тест IAS 2019
                • Пробный тест IAS 2019 1
                • Пробный тест IAS 2019 2
              • Экзамен KPSC KAS
              • Экзамен UPPSC PCS
              • Экзамен MPSC
              • Экзамен RPSC RAS ​​
              • TNPSC Group 1
              • APPSC Group 1
              • Экзамен BPSC
              • WBPS3000 Экзамен 9000 MPC 9000 9000 MPC4000 9000 Jam
            • Вопросник UPSC 2019
              • Ключ ответов UPSC 2019
            • Коучинг IAS
              • IA S Coaching Бангалор
              • IAS Coaching Дели
              • IAS Coaching Ченнаи
              • IAS Coaching Хайдарабад
              • IAS Coaching Mumbai
          • JEE
            • BYJU'SEE
            • 9000 JEE 9000 Основной документ JEE 9000 JEE 9000
            • Вопросник JEE
            • Биномиальная теорема
            • Статьи JEE
            • Квадратичное уравнение
          • NEET
            • Программа BYJU NEET
            • NEET 2020
            • NEET Приемлемость 9000 Критерии 9000 NEET4 9000 NEET 9000 Пример 9000 9000 NEET
            • Поддержка
              • Разрешение жалоб
              • Служба поддержки
              • Центр поддержки
          • Государственные советы
            • GSEB
              • GSEB Syllabus
              • GSEB4
              • GSEB3 Образец статьи
              • GSEB3 004
              • MSBSHSE
                • MSBSHSE Syllabus
                • MSBSHSE Учебники
                • Образцы статей MSBSHSE
                • Вопросники MSBSHSE
              • AP Board
                • APSCERT
                • Syll
                • AP 9000SC4
                • Syll
                • AP
                • Syll 9000SC4
                • Syll
                • Syll
              • MP Board
                • MP Board Syllabus
                • MP Board Образцы документов
                • Учебники MP Board
              • Assam Board
                • Assam Board Syllabus
                • Assam Board Учебники 9000 9000 Board4 BSEB
                  • Bihar Board Syllabus
                  • Bihar Board Учебники
                  • Bihar Board Question Papers
                  • Bihar Board Model Papers
                • BSE Odisha
                  • Odisha Board Syllabus
                  • Odisha Board Syllabus
                  • Odisha Board Syllabus
                  • Программа PSEB
                  • Учебники PSEB
                  • Вопросы PSEB
                • RBSE
                  • Rajasthan Board Syllabus
                  • RBSE Учебники
                  • RBSE Question Papers
                • HPBOSE
                • HPBOSE
                • 000 Syllab HPBOSE
                • JKBOSE
                  • Программа обучения JKBOSE
                  • Образцы документов JKBOSE
                  • Шаблон экзамена JKBOSE
                • TN Board
                  • TN Board Syllabus
                  • TN Board 9000 Papers 9000 TN Board 9000 Papers 9000 9000 Paper Papers 9000 TN Board 9000 4 JAC
                    • Программа JAC
                    • Учебники JAC
                    • Вопросники JAC
                  • Telangana Board
                    • Telangana Board Syllabus
                    • Telangana Board Учебники
                    • Papers Telangana Board Учебники
                    • Учебный план KSEEB
                    • Типовой вопросник KSEEB
                  • KBPE
                    • Учебный план KBPE
                    • Учебники KBPE
                    • Документы по KBPE
                  • 9000 Доска UPMSP 9000 Доска UPMSP 9000 Доска UPMSP 9000
                • Совет по Западной Бенгалии
                  • Учебный план Совета по Западной Бенгалии
                  • Учебники для Совета по Западной Бенгалии
                  • Вопросы для Совета по Западной Бенгалии
                • UBSE
                • TBSE
                • Гоа Совет
                • 000
                • NBSE0003 Board
                • Manipur Board
                • Haryana Board
              • Государственные экзамены
                • Банковские экзамены
                  • Экзамены SBI
                  • Экзамены IBPS
                  • Экзамены RBI
                  • IBPS

                    03
                  • Экзамены SSC
                  • 9SC2

                  • SSC GD
                  • SSC CPO 900 04
                  • SSC CHSL
                  • SSC CGL
                • Экзамены RRB
                  • RRB JE
                  • RRB NTPC
                  • RRB ALP
                • O Экзамены на страхование
                • LIC4
                • LIC4 9000 ADF UPSC CAPF
                • Список статей государственных экзаменов
              • Обучение детей
                • Класс 1
                • Класс 2
                • Класс 3
              • Академические вопросы
                • Вопросы по физике
                • Вопросы по химии
                • Вопросы по химии
                • Вопросы
                • Вопросы по науке
                • Вопросы для общего доступа
              • Онлайн-обучение
                • Домашнее обучение
              • Полные формы
              • CAT
                • BYJU'S CAT Program
                • CAT3 9000 Предварительный курс CAT3
                • Экзамен 9000 9000 CAT3 Экзамен Шаблон экзамена CAT 2020
                • Обзор приложения Byju по CAT
            • КУПИТЬ КУРС
          .

          Что такое гель-электрофорез? | Факты

          Электрофорез - это метод, обычно используемый в лаборатории для разделения заряженных молекул, таких как ДНК, по размеру.

          • Гель-электрофорез - это метод, обычно используемый в лабораториях для разделения заряженных молекул, таких как ДНК, РНК и белки, в зависимости от их размера.
          • Заряженные молекулы движутся через гель, когда через него пропускают электрический ток.
          • Электрический ток проходит через гель, так что один конец геля имеет положительный заряд, а другой конец - отрицательный.
          • Движение заряженных молекул называется миграцией. Молекулы движутся навстречу противоположному заряду. Таким образом, молекула с отрицательным зарядом будет тянуться к положительному концу (противоположности притягиваются!).
          • Гель состоит из проницаемой матрицы, немного похожей на сито, через которую молекулы могут перемещаться при прохождении электрического тока.
          • Более мелкие молекулы мигрируют через гель быстрее и, следовательно, перемещаются дальше, чем более крупные фрагменты, которые мигрируют медленнее и, следовательно, будут перемещаться на меньшее расстояние.В результате молекулы разделяются по размеру.

          Гель-электрофорез и ДНК

          • Электрофорез позволяет различать фрагменты ДНК разной длины.
          • ДНК заряжена отрицательно, поэтому при приложении электрического тока к гелю ДНК будет перемещаться к положительно заряженному электроду.
          • Более короткие нити ДНК проходят через гель быстрее, чем более длинные нити, в результате чего фрагменты располагаются по размеру.
          • Использование красителей, флуоресцентных меток или радиоактивных меток позволяет видеть ДНК на геле после их разделения. Они появятся на геле в виде полос.
          • Маркер ДНК с фрагментами известной длины обычно пропускается через гель одновременно с образцами.
          • Сравнивая полосы образцов ДНК с полосами на маркере ДНК, вы можете определить приблизительную длину фрагментов ДНК в образцах.

          Как проводится гель-электрофорез?

          Подготовка геля

          • Гели агарозы обычно используются для визуализации фрагментов ДНК.Концентрация агарозы, используемой для приготовления геля, зависит от размера фрагментов ДНК, с которыми вы работаете.
          • Чем выше концентрация агарозы, тем плотнее матрица и наоборот. Меньшие фрагменты ДНК разделяются при более высоких концентрациях агарозы, в то время как более крупные молекулы требуют более низкой концентрации агарозы.
          • Для получения геля порошок агарозы смешивают с буфером для электрофореза и нагревают до высокой температуры до тех пор, пока весь порошок агарозы не расплавится.
          • Расплавленный гель затем выливают в лоток для отливки геля, и на одном конце помещают «гребешок», чтобы сделать лунки для образца, в который будет помещаться пипетка.
          • Когда гель остынет и затвердеет (теперь он будет непрозрачным, а не прозрачным), гребешок удаляется.
          • Многие люди сейчас используют готовые гели.
          • Затем гель помещают в емкость для электрофореза, и буфер для электрофореза наливают в емкость до тех пор, пока поверхность геля не будет покрыта. Буфер проводит электрический ток.Тип используемого буфера зависит от приблизительного размера фрагментов ДНК в образце.

          Подготовка ДНК к электрофорезу

          • К образцу ДНК перед электрофорезом добавляют краситель, чтобы увеличить вязкость образца, что предотвратит его выплытие из лунок и так, чтобы миграция образца через гель видно.
          • Маркер ДНК (также известный как стандарт размера или лестница ДНК) загружается в первую лунку геля.Фрагменты в маркере имеют известную длину, поэтому их можно использовать для приблизительного определения размера фрагментов в образцах.
          • Подготовленные образцы ДНК затем пипеткой переносятся в оставшиеся лунки геля.
          • Когда это будет сделано, крышка помещается на резервуар для электрофореза, убедившись, что ориентация геля, положительного и отрицательного электродов правильная (мы хотим, чтобы ДНК перемещалась через гель к положительному концу).

          Разделение фрагментов

          • Затем включается электрический ток, так что отрицательно заряженная ДНК перемещается через гель к положительной стороне геля.
          • Более короткие участки ДНК перемещаются быстрее, чем более длинные, поэтому перемещайтесь дальше во время прохождения тока.
          • Расстояние, на которое ДНК мигрировала в геле, можно определить визуально, наблюдая за миграцией красителя загрузочного буфера.
          • Электрический ток остается включенным достаточно долго, чтобы гарантировать, что фрагменты ДНК перемещаются по гелю достаточно далеко, чтобы разделить их, но не настолько долго, чтобы они стекали с конца геля.

          Иллюстрация оборудования для электрофореза ДНК, используемого для разделения фрагментов ДНК по размеру.Гель находится в резервуаре с буфером. Образцы ДНК помещают в лунки на одном конце геля, и через гель пропускают электрический ток. Отрицательно заряженная ДНК движется к положительному электроду. Изображение предоставлено: Genome Research Limited

          Визуализация результатов

          • После того, как ДНК прошла достаточно далеко по гелю, электрический ток отключается и гель удаляется из электрофореза.
          • Для визуализации ДНК гель окрашивают флуоресцентным красителем, который связывается с ДНК, и помещают на ультрафиолетовый трансиллюминатор, который показывает окрашенную ДНК в виде ярких полос.
          • В качестве альтернативы краситель можно смешать с гелем перед его заливкой.
          • Если гель растекся правильно, будет видна полосатая структура маркера ДНК / стандарта размера.
          • Затем можно судить о размере ДНК в вашем образце, представив горизонтальную линию, проходящую поперек полос маркера ДНК. Затем вы можете оценить размер ДНК в образце, сопоставив их с ближайшей полосой в маркере.

          Иллюстрация, показывающая полосы ДНК, разделенные на геле.Длина фрагментов ДНК сравнивается с маркером, содержащим фрагменты известной длины. Изображение предоставлено: Genome Research Limited

          Эта страница последний раз обновлялась 25.01.2016

          ,Электрофорез нуклеиновой кислоты

          : дополнительные соображения - 7 аспектов | Thermo Fisher Scientific

          DNA bands in E-Gel precast agarose gel

          1.Последовательность и конформация образцов нуклеиновой кислоты

          Основные принципы электрофореза подразумевают, что образцы нуклеиновой кислоты имеют разную скорость подвижности, если они разного размера. Однако нуклеиновые кислоты с одинаковым числом нуклеотидов, но с различным составом последовательностей и конформацией могут иметь разную подвижность во время электрофореза (, рис. 1, ).

          • Последовательность: АТ-богатая ДНК может мигрировать медленнее, чем GC-богатая ДНК того же размера, особенно при электрофорезе высокого разрешения. Точно так же молекулы ДНК с 4-6 аденозиновыми повторами примерно через каждые 10 п.н. (называемые изогнутой ДНК) будут мигрировать нерегулярно, особенно в полиакриламидных гелях [1,2]. Их аномальная миграция, вероятно, связана с составом последовательностей, влияющим на их молекулярную конформацию.
          • Конформация: На миграцию молекул ДНК одной и той же последовательности, но различных конформаций, таких как кольцевые и линеаризованные плазмиды, влияет компактность каждой конформации при их движении через поры геля.Сверхкомпактные сверхспиральные молекулы мигрируют быстрее всего, за ними следуют гибкие линейные и открытые кольцевые молекулы (, рис. 1, ). Эту дифференциальную миграцию можно использовать для исследования целостности плазмидной ДНК после выделения, поскольку интактная плазмидная ДНК желательна в таких применениях, как трансфекция клеток млекопитающих для сверхэкспрессии гена.
          (A) Gel mobility and (B) structures of plasmid in different conformations

          Рисунок 1.Электрофоретическая миграция одной и той же ДНК в различных конформациях. (A) Электрофорез разорванной кольцевой, линейной и суперспиральной плазмидной ДНК. (B) Конформация релаксированной кольцевой, линейной и суперспиральной плазмидной ДНК. Никелированные плазмиды принимают расслабленную открытую кольцевую конформацию и занимают наибольший объем, наиболее медленно мигрируя через гель; линеаризованные плазмиды движутся через гель с немного большей скоростью; неповрежденные сверхспиральные плазмиды, будучи самыми компактными, мигрируют быстрее всего.

          Верх

          2. Свойства агарозных и акриламидных реагентов, которые следует учитывать при электрофорезе.

          Размер и желаемое разрешение разделяемых образцов нуклеиновой кислоты часто определяют выбор между агарозным или полиакриламидным гелем (узнайте больше о двух вариантах геля).Как правило, более высокие процентные содержания геля более эффективны для разделения более мелких молекул. Таблица 1 обобщает свойства, которые следует учитывать при выборе реагентов агарозного и акриламидного гелей для электрофореза нуклеиновых кислот.

          Таблица 1. Свойства реагентов агарозы и акриламидного геля, относящиеся к электрофорезу [3,4].

          Имущество Последствия
          Ясность Агароза образует полупрозрачные гели.Следовательно, агароза с более высокими характеристиками прозрачности обеспечивает минимальный фон флуоресценции во время визуализации и документирования геля.
          Электроэндосмос (ЭЭО) Во время электрофореза на движение буфера по направлению к электроду может влиять взаимодействие между ионами буфера и молекулами заряда внутри и на поверхности агарозной матрицы в процессе, известном как электроэндосмос или ЭЭО. Поскольку положительно заряженные ионы (катионы) буфера текут в направлении, противоположном нуклеиновым кислотам ( Рисунок 2A ), агароза с более высокими отрицательными зарядами может влиять на движение катионов и, следовательно, на разделение больших нуклеиновых кислот (> 10 т.п.н.).
          Значение EEO можно рассматривать как косвенный индикатор количества отрицательно заряженных групп в агарозе. Атомы кислорода на боковых цепях агарозы (обозначены X на рис. 2B ) могут нести атомы водорода (X = H) или отрицательно заряженные группы, такие как сульфат (SO 3 - ) и пируват (CH 3 ). COCOO - ). Поскольку отрицательные заряды привлекают буферные катионы, присутствие этих групп на агарозе снижает эффективность и разрешение разделения нуклеиновых кислот.
          Точка гелеобразования Точка гелеобразования указывает температуру, при которой раствор агарозы образует гель. Чем выше процент геля, тем выше точка гелеобразования.
          Прочность геля Прочность геля, выраженная в единицах силы (г / см. 2 ), соответствует способности геля противостоять разрушению и зависит от концентрации агарозы. Чем выше прочность геля, тем легче с ним обращаться.
          Генетическое качество Генетическое качество (GQ) показывает, подходит ли агароза для применения в молекулярной биологии, исходя из уровней загрязнителей и ингибиторов ферментов.
          Температура плавления Точка плавления - это температура плавления агарозы. Поскольку желированная агароза плавится при нагревании, температура плавления всегда выше, чем точка гелеобразования. Агароза с низкой температурой плавления (LMP) представляет собой особый тип агарозы, которая плавится при значительно более низкой температуре (~ 25 ° C), чем стандартная агароза.LMP-агароза также имеет более низкую точку гелеобразования, что полезно для экстракции крупных нуклеиновых кислот и проведения ферментативных реакций в геле, таких как лигирование.
          Имущество Последствия
          Уровень молекулярной биологии Высококачественные реагенты, соответствующие требованиям молекулярной биологии, были протестированы на нуклеазную активность и наличие загрязняющих веществ.Эта квалификация может помочь защитить целостность образцов нуклеиновых кислот во время электрофореза.
          Стабильность / срок хранения Коммерчески приготовленные исходные растворы полиакриламида часто стабилизируют инфузией с газом, чтобы продлить их стабильность. Если вы готовите собственные исходные растворы полиакриламида в своей лаборатории, их следует использовать в течение нескольких месяцев, поскольку они со временем распадаются на акриловую кислоту. Акриламид и бисакриламид в порошке или растворе следует хранить в темных контейнерах, чтобы защитить их от света.

          Раствор сульфата аммония (APS) лучше всего готовить в свежем виде для образования свободных радикалов, чтобы инициировать полимеризацию геля. Приготовленный раствор можно хранить при 4 ° C около месяца, но его эффективность со временем снижается.

          Тетраметилэтилендиамин (ТЕМЕД), реагент, который стабилизирует свободные радикалы, образующиеся при полимеризации геля, следует хранить плотно закрытым для предотвращения окисления.

          (Подробнее: Основы полиакриламида)

          Общий процент мономеров, мас. / Об. (% T) Общий процент мономерного акриламида и сшивающего бисакриламида в растворе (% T) определяет размер пор полиакриламидного геля.Например, 10% -ный полиакриламидный гель состоит из 10% (мас. / Об.) Акриламида и бисакриламида. Чем выше% T, тем меньше размер пор и выше разрешающая способность для разделения более мелких молекул (подробнее: рекомендуемый% полиакриламидных гелей).
          Процент сшивающего агента (% C) % C относится к количеству сшивающего агента по отношению к общему количеству мономеров (мас. / Мас.). При заданном% T, чем выше% C, тем меньше размер пор.% C также может быть представлено как отношение акриламида к бисакриламиду (например, 5% C как 19: 1). Полиакриламидные гели с 5% C (19: 1) и 3,3% C (29: 1) чаще всего используются в электрофорезе нуклеиновых кислот.
          Имущество Последствия
          Ясность Агароза образует полупрозрачные гели.Следовательно, агароза с более высокими характеристиками прозрачности обеспечивает минимальный фон флуоресценции во время визуализации и документирования геля.
          Электроэндосмос (ЭЭО) Во время электрофореза на движение буфера по направлению к электроду может влиять взаимодействие между ионами буфера и молекулами заряда внутри и на поверхности агарозной матрицы в процессе, известном как электроэндосмос или ЭЭО. Поскольку положительно заряженные ионы (катионы) буфера текут в направлении, противоположном нуклеиновым кислотам ( Рисунок 2A ), агароза с более высокими отрицательными зарядами может влиять на движение катионов и, следовательно, на разделение больших нуклеиновых кислот (> 10 т.п.н.).
          Значение EEO можно рассматривать как косвенный индикатор количества отрицательно заряженных групп в агарозе. Атомы кислорода на боковых цепях агарозы (обозначены X на рис. 2B ) могут нести атомы водорода (X = H) или отрицательно заряженные группы, такие как сульфат (SO 3 - ) и пируват (CH 3 ). COCOO - ). Поскольку отрицательные заряды привлекают буферные катионы, присутствие этих групп на агарозе снижает эффективность и разрешение разделения нуклеиновых кислот.
          Точка гелеобразования Точка гелеобразования указывает температуру, при которой раствор агарозы образует гель. Чем выше процент геля, тем выше точка гелеобразования.
          Прочность геля Прочность геля, выраженная в единицах силы (г / см. 2 ), соответствует способности геля противостоять разрушению и зависит от концентрации агарозы. Чем выше прочность геля, тем легче с ним обращаться.
          Генетическое качество Генетическое качество (GQ) показывает, подходит ли агароза для применения в молекулярной биологии, исходя из уровней загрязнителей и ингибиторов ферментов.
          Температура плавления Точка плавления - это температура плавления агарозы. Поскольку желированная агароза плавится при нагревании, температура плавления всегда выше, чем точка гелеобразования. Агароза с низкой температурой плавления (LMP) представляет собой особый тип агарозы, которая плавится при значительно более низкой температуре (~ 25 ° C), чем стандартная агароза.LMP-агароза также имеет более низкую точку гелеобразования, что полезно для экстракции крупных нуклеиновых кислот и проведения ферментативных реакций в геле, таких как лигирование.
          Имущество Последствия
          Уровень молекулярной биологии Высококачественные реагенты, соответствующие требованиям молекулярной биологии, были протестированы на нуклеазную активность и наличие загрязняющих веществ.Эта квалификация может помочь защитить целостность образцов нуклеиновых кислот во время электрофореза.
          Стабильность / срок хранения Коммерчески приготовленные исходные растворы полиакриламида часто стабилизируют инфузией с газом, чтобы продлить их стабильность. Если вы готовите собственные исходные растворы полиакриламида в своей лаборатории, их следует использовать в течение нескольких месяцев, поскольку они со временем распадаются на акриловую кислоту. Акриламид и бисакриламид в порошке или растворе следует хранить в темных контейнерах, чтобы защитить их от света.

          Раствор сульфата аммония (APS) лучше всего готовить в свежем виде для образования свободных радикалов, чтобы инициировать полимеризацию геля. Приготовленный раствор можно хранить при 4 ° C около месяца, но его эффективность со временем снижается.

          Тетраметилэтилендиамин (ТЕМЕД), реагент, который стабилизирует свободные радикалы, образующиеся при полимеризации геля, следует хранить плотно закрытым для предотвращения окисления.

          (Подробнее: Основы полиакриламида)

          Общий процент мономеров, мас. / Об. (% T) Общий процент мономерного акриламида и сшивающего бисакриламида в растворе (% T) определяет размер пор полиакриламидного геля.Например, 10% -ный полиакриламидный гель состоит из 10% (мас. / Об.) Акриламида и бисакриламида. Чем выше% T, тем меньше размер пор и выше разрешающая способность для разделения более мелких молекул (подробнее: рекомендуемый% полиакриламидных гелей).
          Процент сшивающего агента (% C) % C относится к количеству сшивающего агента по отношению к общему количеству мономеров (мас. / Мас.). При заданном% T, чем выше% C, тем меньше размер пор.% C также может быть представлено как отношение акриламида к бисакриламиду (например, 5% C как 19: 1). Полиакриламидные гели с 5% C (19: 1) и 3,3% C (29: 1) чаще всего используются в электрофорезе нуклеиновых кислот.
          (A) Direction of nucleic acid and buffer cation flows in electrophoresis. (B) Chemical structure of an agarose unit

          Рисунок 2.(А) Движение буферных катионов относительно нуклеиновых кислот во время электрофореза. (B) Структура агарозного элемента с положениями на кислороде, которые могут нести отрицательно заряженные группы (обозначены X).

          Верх

          3. Толщина геля и размеры лунок.

          Толщина геля и размер лунки также могут влиять на результаты электрофореза как с агарозным, так и с полиакриламидным гелем [3].

          Как правило, более толстых гелей могут вызывать диффузию полос из-за большего количества тепла, выделяемого во время прогонов геля. Субоптимальная визуализация также может происходить из-за высокого фона гелевого окрашивания или продолжительности времени, необходимого для окрашивания и / или обесцвечивания геля (если проводится окрашивание после электрофореза). Для гелей агарозы обычно хорошо подходит толщина 3–4 мм, а гели толще 5 мм не рекомендуются. Толщина полиакриламидных гелей определяется прокладками для гелевых литых пластин, поставляемыми производителями, наиболее распространенными из которых являются 0.75 мм, 1,0 мм и 1,5 мм.

          Размер лунки , определяемый формой гелевой гребенки, влияет не только на то, сколько пробы можно загрузить, но и на разрешение полос. В то время как более крупные лунки подходят для увеличенной загрузки образца, они могут давать толстые полосы, уменьшая разрешение полос и создавая размытость. С другой стороны, длинные и узкие лунки вмещают меньшие количества образца, но часто дают более четкие и четко определенные полосы для лучшего разрешения. Более компактные сэмплы также обеспечивают более высокую интенсивность полосы при меньшем вводе.

          4. Типы работающих буферов

          Два обычных рабочих буфера, используемых в электрофорезе нуклеиновых кислот, - это трис-ацетатный ЭДТА (ТАЕ) и трис-боратный ЭДТА (ТВЭ) [5] (см. Также этап обработки геля в предыдущем разделе). Образцы с более низкой молекулярной массой (например,g., ДНК <1000 п.н.) лучше разделяются с помощью буфера TBE , который имеет высокую ионную силу и буферную способность; более крупные фрагменты ДНК имеют тенденцию плохо разделяться в буфере TBE. Для денатурирующего электрофореза, который используется для разделения молекул, которые имеют тенденцию к образованию вторичных структур, таких как РНК, обычно используется буфер TBE; например, полиакриламидные гели в основном готовят с буфером ТВЕ с добавлением 7-8 М мочевины или аналогичного денатурирующего агента для поддержания однонитевой нуклеиновой кислоты.

          Для разделения нуклеиновых кислот с большей молекулярной массой (например, ДНК ≥12–15 т.п.н.) предпочтительным является буфер TAE вместе с низкой напряженностью поля (1-2 В / см). Буфер TAE способствует увеличению видимого размера пор геля, уменьшает электроэндосмос (это относительно менее заряженный буфер) и снижает напряженность поля, что снижает склонность больших молекул к размазыванию [6].

          Верх

          5.Электрические параметры работы: напряжение, ток и мощность

          Для разделения образцов с помощью электрофореза прикладывают электрическое поле, так что отрицательно заряженные нуклеиновые кислоты мигрируют к положительному электроду. Следовательно, электрические параметры, определяющие электрофорез, могут влиять на миграцию образца и разрешение составляющих его фрагментов [7,8].

          Следующие уравнения, полученные из закона Ома, могут использоваться для выражения того, как напряжение ( В, ), ток ( I ) и мощность ( P ) могут влиять на результаты электрофореза.

          Напряжение = ток x сопротивление, или В = I x R
          Мощность = ток x напряжение, или P = I x V
          Мощность может быть выражена как P = I 2 x R , поскольку V = Я х Р.

          Сопротивление (R) во время прогрева геля присуще системе. Например, буфер (проводимость и буферная емкость), температура, свойства геля (процентное содержание, высота, длина, число, поперечное сечение) и т. Д. Системы - все это влияет на сопротивление. В проводящей среде сопротивление уменьшается при повышении температуры, поскольку более высокие температуры позволяют протекать большему току.Однако в процессе нанесения геля сопротивление может изменяться.

          Еще одним важным фактором электрофореза является тепло. Вырабатываемое тепло прямо пропорционально мощности, потребляемой системой, и зависит от буферной проводимости, приложенного напряжения и сопротивления. Чем выше проводимость буфера (особенно если он состоит из небольших ионов), тем сильнее протекает ток. Течение тока также увеличивается за счет высокого напряжения и низкого сопротивления. Увеличение общего тока увеличивает мощность и тепло, выделяемое системой.

          Таблица 2 описывает, как сопротивление и тепло влияют на воздействие постоянного напряжения, мощности и тока на систему электрофореза. Независимо от того, какой электрический параметр установлен постоянным с источником питания, напряжение должно быть ограничено до немного ниже максимального значения, которое может выдержать система, чтобы избежать перегрева и повреждения оборудования и образцов. Общая рекомендация - установить достаточно высокие электрические рабочие параметры для эффективного разделения образцов без выделения чрезмерного тепла.

          Таблица 2. Напряжение, мощность и ток при электрофорезе.

          Напряжение (В) Мощность (P) Ток (I)
          Описание
          • В = I x R
          • Соответствует разнице электрических потенциалов между двумя электродами гелевой системы
          • P = I x V или P = I 2 x R
          • Измеряет скорость преобразования энергии, которая соотносится с теплом, выделяемым системой.
          • I = V / R
          • Обозначает поток буферных ионов и напрямую коррелирует с приложенным напряжением
          Значение электрофореза
          • Напряжение влияет на напряженность поля (В / см).
          • Более высокое напряжение перемещает заряженные молекулы быстрее.
          • Рекомендуется постоянное напряжение, так как оно обеспечивает максимальный контроль над скоростью миграции образца.
          • Изменение сопротивления (R) (например, из-за разного количества и поперечного сечения гелей) в данной системе компенсируется изменениями тока (I) при постоянном напряжении (V = I x R), поддерживая скорость миграции образца относительно постоянна.
          • Постоянная мощность предотвращает перегрев системы, но может привести к изменчивой подвижности образца.
          • Истощение буферных ионов (снижение тока) в течение длительного цикла геля может привести к постепенному увеличению напряжения для поддержания постоянной мощности (P = I x V).
          • Изоэлектрическое фокусирование (IEF) белков представляет собой приложение постоянной мощности, при котором желательно постепенное увеличение напряжения для «фокусировки» образцов в узкие зоны по завершении прогонов геля.
          • Ток вносит вклад в мощность (P = I 2 x R) на порядок величины два.
          • Постоянный ток поддерживает относительно постоянное потребление энергии и тепловыделение системы (в непрерывных гелях без радиации для нуклеиновых кислот).
          • При прерывистом или градиентном гель-электрофорезе белков постоянный ток может быть полезен для штабелирования образцов. Поскольку I = V / R, когда образцы попадают в гели с более высоким процентным содержанием (с повышенным сопротивлением), напряжение также увеличивается, чтобы поддерживать постоянным ток, оказывая на образцы большую электрическую силу в процессе.

          Верх

          6. Общие свойства флуоресцентных красителей для нуклеиновых кислот.

          Флуоресцентные красители часто используются для окрашивания образцов нуклеиновых кислот при электрофорезе для визуализации. Помимо чувствительности, характеристики красителей, такие как длина волны возбуждения, сродство связывания и скорость проникновения геля, могут влиять на рабочий процесс и применение электрофореза (, таблица 3, ) [9].

          Таблица 3. Общие свойства флуоресцентных красителей, используемых при окрашивании нуклеиновых кислот.

          Имущество Последствия
          Сродство привязки Аффинность связывания красителя является важным фактором, поскольку при связывании красителя с образцами часто наблюдается усиление флуоресценции. Как правило, красители нуклеиновых кислот обладают более высоким сродством к двухцепочечным молекулам (например,g., ДНК), чем одноцепочечные молекулы (например, РНК), так как с двухцепочечными спиралями легче связываться. Для РНК-электрофореза уникальные красители с более высоким сродством к одноцепочечным молекулам могут повысить специфичность и чувствительность обнаружения РНК.
          Совместимость с денатурантами Мочевина и формамид обычно используются в качестве денатурирующих агентов при электрофорезе РНК. Красители, устойчивые к тушению этими денатурантами, следует учитывать при денатурирующем электрофорезе для повышения эффективности.В противном случае денатурирующие гели следует промыть, чтобы удалить денатурирующие вещества перед окрашиванием.
          Динамический диапазон Динамический диапазон представляет порядки величины, в которых происходит линейное определение количества пробы. Следовательно, красители с более широким динамическим диапазоном позволяют более точно определять количество полос в геле.
          Длина волны возбуждения Более длинные волны вызывают меньшую энергию, что означает меньшее повреждение нуклеиновых кислот.Таким образом, красители, возбуждаемые синим светом, лучше защищают целостность образца, чем красители, возбуждаемые УФ-светом. Такие эффекты могут иметь явные последствия для последующих приложений, таких как эффективность клонирования.
          Проникновение геля Красители, которые быстрее проникают в гели, не только сокращают рабочий процесс, но и лучше окрашивают густые и высокопроцентные гели при использовании после электрофореза.
          Собственная флуоресценция Красители с низкой собственной флуоресценцией приводят к более низкому фону при окрашивании геля, устраняя необходимость обесцвечивания и улучшая обнаружение.
          Мутагенность Флуоресцентные красители, используемые при окрашивании нуклеиновых кислот, часто обладают мутагенными свойствами из-за их интеркалирующих свойств. Красители, которые оказались менее мутагенными и классифицированы как неопасные, должны быть рассмотрены для обеспечения дополнительной безопасности и удобной утилизации.

          Верх

          7. Связывание красителя с образцами: методы окрашивания в геле и после электрофореза.

          Два распространенных подхода к окрашиванию образцов нуклеиновых кислот:

          (1) In-gel , где краситель включен в гель (и рабочий буфер)
          (2) Постэлектрофорез , где гель окрашивается в отдельной ванне после завершения цикла

          Каждый из этих двух методов имеет свои преимущества и недостатки, как указано в , Таблица 4 .

          Таблица 4. Преимущества и особенности окрашивания в геле по сравнению с окрашиванием после электрофореза.

          Методы Преимущества Рекомендации
          Окрашивание в геле
          • Удобнее
          • Более быстрый рабочий процесс
          • Требуется меньше морилки
          • Пятно может стекать после длительного использования
          • Пятно можно использовать только один раз
          • Может изменить подвижность образца
          Окрашивание после электрофореза
          • Обеспечивает более точный анализ размеров молекул
          • Позволяет повторно использовать окрашивающие растворы или использовать с несколькими гелями
          • Более длинный рабочий процесс
          • Требуется больше морилки
          • Могут быть более опасными

          Окрашивание в геле более удобно и требует меньше красителя для визуализации.Однако положительно заряженный краситель мигрирует в направлении, противоположном нуклеиновым кислотам, что может повлиять на обнаружение образцов с более низкой молекулярной массой, особенно в течение длительного периода (, рис. 3A, ). Кроме того, связывание красителей с нуклеиновыми кислотами может изменить миграцию образца, явление, известное как сдвиг геля, когда образцы не соответствуют размеру (, рис. 3В, ). Кроме того, высокие уровни интеркалирующих красителей, включенных в гели, могут изменять конформацию суперспиральной плазмидной ДНК, изменяя их подвижность (кажущуюся молекулярную массу) при электрофорезе [10].

          Поскольку окрашивание после электрофореза не влияет на образцы во время электрофореза, это предпочтительный метод для точного определения размеров образцов. Однако этот метод увеличивает время рабочего процесса, использует больше красителя и приводит к более опасным отходам при использовании красителей, таких как бромистый этидий.

          (A) Stain migration during electrophoresis. (B) Differences in DNA migration between in-gel vs. post-electrophoresis staining

          Рисунок 3.Результаты гель-электрофореза нуклеиновых кислот с интеркалирующим красителем. (A) Бромид этидия, включенный в гель, движется в направлении, противоположном направлению нуклеиновых кислот. Желтая линия отмечает границу между флуоресцентным фоном бромистого этидия и областью геля, где краситель был истощен. (B) Большой интеркалирующий краситель, когда он включен в гель, в отличие от применяемого постэлектрофореза, влияет на миграцию полос образца. Чтобы проиллюстрировать эффект, две лестницы запускали бок о бок в двух гелях.Высокомолекулярная лестница (полоса 1) мигрировала одинаково в обоих гелях (синие линии отмечают контрольные полосы, которые показывают сопоставимые положения полос). Низкомолекулярная лестница (дорожка 2) по-разному перемещалась в присутствии красителя во время электрофореза.

          Верх

          Таким образом, выбор соответствующих реагентов, параметров и методов в дополнение к настройке рабочего процесса жизненно важен для достижения оптимальных результатов электрофореза для разделения и анализа нуклеиновых кислот

          ,

          Смотрите также